สารพันธุกรรม การทำความเข้าใจเกี่ยวกับวิธีการวินิจฉัยสารพันธุกรรม

สารพันธุกรรม วิธีการวินิจฉัยดีเอ็นเอหลายวิธีขึ้นอยู่กับ 2 วิธีพื้นฐาน การวิเคราะห์การผสมพันธุ์แบบหยดและ PCR การวิเคราะห์การผสมพันธุ์แบบหยด การวิเคราะห์การผสมพันธุ์แบบบล็อตเป็นวิธีแรก ในการศึกษาโมเลกุลดีเอ็นเอ

ซึ่งเสนอโดยเซาท์เทิร์นในปี 2518 วิธีนี้ได้กลายเป็นพื้นฐานทางเทคโนโลยีสากล สำหรับการระบุการกลายพันธุ์ในยีนทางพยาธิวิทยา สาระสำคัญของวิธีการมีดังนี้ดีเอ็นเอที่แยกได้ จากตัวอย่างชิ้นเนื้อของอวัยวะ และเพาะเชื้อของเซลล์เม็ดเลือดขาว

เลือดผ่านความแตกแยกโดยข้อจำกัด ซึ่งจดจำลำดับนิวคลีโอไทด์ที่กำหนดไว้อย่างเคร่งครัดในนั้น แม้จะมีการตัดโดยเอนไซม์จำกัดของชิ้นส่วนดีเอ็นเอ จำนวนมากที่มีความยาวต่างกัน ชุดของพวกมันสำหรับแต่ละตัวจะคงที่เสมอ

ในแง่ของจำนวนและขนาดของเอนไซม์จำกัดนี้ ถัดไปจากชุดของชิ้นส่วนที่ถูกตัด จะต้องพบและระบุชิ้นส่วนดีเอ็นเออย่างน้อย 1 ชิ้นที่มีลำดับที่แน่นอนเพื่อจุดประสงค์นี้ ส่วนผสมของชิ้นส่วนที่เป็นผลลัพธ์ จะต้องผ่านกระบวนการอิเล็กโทรโฟรีซิส

ซึ่งในระหว่างนั้นชิ้นส่วนดีเอ็นเอจะถูกแยกตามขนาดชิ้นเล็กๆ ในเจลจะเคลื่อนที่ได้เร็วกว่าชิ้นใหญ่ จากนั้นชิ้นส่วนที่แยกออกมาจะถูกพิมพ์ซ้ำ บนตัวกรองเซลลูโลสหรือเมมเบรนไนลอน ตรึงไว้และอยู่ภายใต้การผสมพันธุ์ด้วยโพรบ

ซึ่งโพรบดังกล่าวเป็นองค์ประกอบสำคัญ เป็นลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนเฉพาะที่โคลนเทียม โดยใช้วิธีการทางพันธุวิศวกรรม เป็นหัววัดที่ตรวจจับชิ้นส่วนที่จำเป็นซึ่งอยู่ในชุดชิ้นส่วนที่ศึกษา ในกรณีนี้การเชื่อมโยงเฉพาะของลำดับโพรบกับลำดับเสริม

ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่จับจ้องอยู่ที่ตัวกรองจะเกิดขึ้น ตามมาด้วยการล้างฉลากกัมมันตภาพรังสี ที่ไม่ผูกติดอยู่กับตัวกรองออก และการเปิดเผยของชิ้นส่วนบนฟิล์มเอกซเรย์ การเปลี่ยนแปลงตำแหน่งของชิ้นส่วน เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม

การหายไปหรือการปรากฏตัวของชิ้นส่วนใหม่ บ่งชี้ถึงการจัดเรียงใหม่ในลำดับนิวคลีโอไทด์ในยีน ภายใต้การศึกษาหรือสภาพแวดล้อมในทันที ปัจจุบันการวิเคราะห์การผสมข้ามพันธุ์แบบบล็อต มีการใช้งานอย่างจำกัดสำหรับการผสม

ระหว่างโพรบดีเอ็นเอกับโมเลกุลอาร์เอ็นเอที่แยกด้วยไฟฟ้า นอร์เทิร์นบล็อตหรือโมเลกุลโปรตีน ที่ติดอยู่บนตัวกรองที่มีแอนติบอดีติดฉลากเวสเทิร์นบล็อต ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส PCR เป็นวิธีการที่สำคัญที่สุดเป็นอันดับ 2

ในการวินิจฉัย ดีเอ็นเอ ซึ่งเป็นวิธีการขยายเฉพาะ การคัดลอกหรือการคูณ เอนไซม์จำกัดเป็น กรรไกรชีวภาพชนิดหนึ่ง ในปัจจุบันมีเอนไซม์จำกัดที่จดจำลำดับนิวคลีโอไทด์จำเพาะได้มากกว่า 500 ลำดับที่มีความยาวตั้งแต่ 4 ถึง 8 คู่ขึ้นไป

การวิเคราะห์การผสมพันธุ์แบบหยด แทนที่อย่างมาก วิธี PCR ถูกเสนอในปี 1983 โดยมัลลิส ผู้ซึ่งได้รับรางวัลโนเบลในปี 1992 จากการพัฒนาของเขา วิธี PCR ทำให้สามารถเพิ่มปริมาณของชิ้นส่วนจีโนมดีเอ็นเอ

ในหลอดทดลองได้หลายล้านเท่า มีความยาวตั้งแต่หลายสิบถึงหลายพัน bp ภายใน 1 ชั่วโมง ซึ่งช่วยอำนวยความสะดวกอย่างมากในการค้นหาการกลายพันธุ์ ที่ต้องการหรือการศึกษา เงื่อนไขที่จำเป็นสำหรับการทำ PCR คือความรู้เกี่ยวกับลำดับนิวคลีโอไทด์

สารพันธุกรรม ที่ขนาบข้างตำแหน่งการขยายอยู่ที่ด้านข้าง ไซต์ดังกล่าวเรียกว่าเมล็ดหรือโอลิโกไพรเมอร์ ความยาวของพวกมันคือ 20 ถึง 30 คู่เบส พวกมันประกอบกันที่ปลาย 3 ของบริเวณที่ขยายได้บนสายดีเอ็นเอ ความรู้สึกและแอนติเซนส์

ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของการเติมเต็ม ความยาวของขอบเขตที่ขยายถูกกำหนดโดย สอดคล้องกับระยะห่างระหว่างโอลิโกไพรเมอร์ แผนผังของ PCR ดำเนินการในสี่ขั้นตอนบนวงจรความร้อนซอฟต์แวร์พิเศษที่ตั้งและคงไว้

ซึ่งระบอบอุณหภูมิที่แน่นอนของปฏิกิริยา ส่วนประกอบของปฏิกิริยานี้คือเทมเพลตดีเอ็นเอ โอลิโกไพรเมอร์ ส่วนผสมของดีออกซีนิวคลีโอไทด์และเทอร์โมฟิลิก ดีเอ็นเอโพลิเมอร์เรส พวกเขาจะถูกเพิ่มลงในบัฟเฟอร์น้ำเกลือพิเศษทันที

ก่อนที่จะวางท่อในวงจรความร้อน ในขั้นตอนแรกของปฏิกิริยาดีเอ็นเอ แม่แบบที่มีเกลียวสองเส้นจะถูกแปลงเป็นรูปแบบที่มีเกลียวเดี่ยว โดยการให้ความร้อนเป็นเวลาหลายนาทีจนถึงอุณหภูมิ 95 ถึง 98 องศาเซลเซียส

ในขั้นตอนที่ 2 ขั้นตอนการผสมพันธุ์ อุณหภูมิของส่วนผสมของปฏิกิริยาจะลดลงเหลือ 30 ถึง 50 องศาเซลเซียส และโอลิโกไพรเมอร์จะถูกผสมเข้ากับดีเอ็นเอที่ถูกทำให้เสียสภาพ สายเดี่ยวที่มีบริเวณเสริม

ในขั้นตอนที่สามอุณหภูมิจะสูงขึ้นถึง 60 ถึง 70 องศาเซลเซียสเหมาะสำหรับเทอร์โมฟิลิก ดีเอ็นเอโพลิเมอเรสซึ่งช่วยให้คุณเริ่มการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ ในทิศทางจากปลาย 5 ถึง 3 ของแม่แบบดีเอ็นเอจีโนม ในขั้นตอนที่สี่อุณหภูมิจะสูงขึ้นอีกเป็น 80 ถึง 90 องศาเซลเซียส

ซึ่งจะหยุดการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ และการเสียสภาพธรรมชาติจะเริ่มต้นด้วยการปล่อยชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ที่สังเคราะห์ขึ้นจากแม่แบบจีโนม เป็นผลให้ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่เป็นผลลัพธ์กลายเป็นแม่แบบ สำหรับรอบการขยายสัญญาณถัดไป

และกระบวนการสามารถดำเนินการแบบทวีคูณ ทำให้ได้จำนวนรอบที่ต้องการ หากการขยายเต็มหนึ่งรอบใช้เวลา 1 ถึง 2 นาที จากนั้นภายใน 25 ถึง 30 รอบจำนวนสำเนาดีเอ็นเอที่สังเคราะห์ได้จะสูงถึงหลายล้านชุด

ในกรณีนี้การเลือกโหมดการทำงานที่เหมาะสมที่สุด จะพิจารณาจากความยาวและความจำเพาะ ของบริเวณขยายของโมเลกุลดีเอ็นเอ การวิเคราะห์ผล PCR ดำเนินการโดยใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิสของผลิตภัณฑ์แอมพลิฟายเออร์

ซึ่งหากจำเป็นจะถูกประมวลผลด้วยข้อจำกัด ต่อจากนั้นเจลจะถูกย้อมด้วยเอทิเดียมโบรไมด์ และผลิตภัณฑ์ที่มีข้อจำกัดจะถูกตรวจสอบในแสงยูวีแบบส่องผ่าน ที่มีความยาวคลื่น 380 นาโนเมตรเพื่อดูว่ามีการกลายพันธุ์ที่ตรวจไม่พบในเจลหรือไม่

ดังนั้น PCR จึงทำหน้าที่เป็นแบบจำลองสากล สำหรับการได้รับตัวอย่างชิ้นส่วนดีเอ็นเอ ที่กำหนดการพัฒนาของพยาธิสภาพทางพันธุกรรม ในปัจจุบันการตรวจวินิจฉัยจำนวนมาก ได้รับการพัฒนาโดยใช้ PCR เพื่อวินิจฉัยพยาธิสภาพทางพันธุกรรมในรูปแบบต่างๆได้อย่างมีประสิทธิภาพ

บทความที่น่าสนใจ : ฮอร์โมน อธิบายสาเหตุของความผิดปกติของต่อมไร้ท่อและฮอร์โมน